Analisi genomica e trascrittomica della risposta al blocco del checkpoint nei pazienti non avanzati

Nature Genetics volume 55, pagine 807–819 (2023) Citare questo articolo

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Gli agenti anti-PD-1/PD-L1 hanno trasformato il panorama terapeutico del cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC) avanzato. Per ampliare la nostra comprensione delle caratteristiche molecolari alla base della risposta agli inibitori del checkpoint nel NSCLC, descriviamo qui la prima analisi congiunta della coorte della Stand Up To Cancer-Mark Foundation, una risorsa di sequenziamento dell'intero esoma e/o dell'RNA di 393 pazienti con NSCLC trattati con terapia anti-PD-(L)1, insieme all'annotazione della risposta clinica corrispondente. Identifichiamo una serie di associazioni tra caratteristiche molecolari e risultati, inclusi (1) sottogruppi genomici favorevoli (ad esempio, ATM alterato) e sfavorevoli (ad esempio, TERT amplificato), (2) un'associazione prominente tra l'espressione di componenti inducibili dell'immunoproteasoma e risposta e (3) un sottotipo intrinseco del tumore dedifferenziato con una risposta potenziata al blocco del checkpoint. Nel loro insieme, i risultati di questa coorte dimostrano la complessità dei determinanti biologici alla base dei risultati dell’immunoterapia e rafforzano il potenziale di scoperta dell’analisi integrativa all’interno di coorti ampie, ben curate e specifiche per il cancro.

L’introduzione degli inibitori PD-1/PD-L1 nella gestione del carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) avanzato ha portato a un importante cambiamento di paradigma nel trattamento della malattia. A seguito di numerosi studi che hanno dimostrato un miglioramento della sopravvivenza globale, questi agenti hanno ottenuto l'approvazione da soli1,2,3,4 o in combinazione con la chemioterapia5,6 o il blocco CTLA47. Tuttavia, poiché le risposte sono state osservate solo in un paziente non selezionato su cinque1,2,3, sono necessari migliori predittori di risposta per identificare i pazienti con maggiori probabilità di trarne beneficio.

Dato che il potenziale per il controllo della malattia a lungo termine è realizzato solo in una minoranza di pazienti, sono stati dedicati grandi sforzi all’identificazione dei biomarcatori di risposta e resistenza. I biomarcatori dominanti fino ad oggi sono l’espressione della proteina PD-L1 sulle membrane delle cellule tumorali4 e il carico mutazionale del tumore (TMB)8,9,10, che potrebbe essere alla base della generazione di neoantigeni che possono fungere da bersagli per il riconoscimento e il targeting immunitario.

Sebbene abbiano iniziato ad emergere ulteriori caratteristiche, tra cui potenziali ruoli per la clonalità della mutazione11, un microambiente infiammato12,13 e alterazioni nei singoli geni come EGFR14,15 e STK11 (rif. 16), l'ulteriore identificazione e integrazione di predittori rilevanti è stata ostacolata dall'assenza di ampie coorti di pazienti multi-omici specifici per NSCLC.

Qui descriviamo i risultati della prima analisi integrativa della coorte NSCLC della Stand Up To Cancer-Mark Foundation (SU2C-MARK), un set di dati di 393 pazienti trattati con inibitori del checkpoint in stadio avanzato. Abbiamo eseguito il sequenziamento dell'intero esoma (WES) e il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) insieme a valutazioni dettagliate della risposta clinica, consentendo la valutazione composita dei biomarcatori genomici e trascrittomici di risposta e resistenza. Nel complesso, questi dati riccamente annotati costituiranno una risorsa sul campo per promuovere l'indagine sia di base che applicata sul ruolo degli agenti PD-1/PD-L1 nel NSCLC avanzato.

Abbiamo analizzato campioni di tumore fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) raccolti prima del ricevimento del blocco del checkpoint (definito come la prima linea di terapia in cui un paziente ha ricevuto un agente PD-1/PD-L1) da un totale di 393 pazienti con malattia avanzata NSCLC in nove centri oncologici (Tabella 1 e Fig. 1a). La maggior parte di questi pazienti è stata trattata con terapia con agente singolo (81%), con sottogruppi aggiuntivi che hanno ricevuto una terapia di combinazione comprendente il blocco di CTLA4 (17%) o chemioterapia (1%). Sia il tumore che i campioni normali abbinati (dal sangue o, in rari casi, dal tessuto normale adiacente) sono stati sottoposti a WES; per un sottogruppo di pazienti, il tessuto tumorale è stato inoltre profilato dall'intero trascrittoma RNA-seq. Dopo un rigoroso controllo di qualità (metodi), sono stati inclusi per l'analisi un totale di 309 campioni WES e 152 campioni RNA-seq. L'outcome primario era la migliore risposta complessiva (BOR) determinata da una revisione dedicata dell'imaging clinico e quantificata utilizzando i criteri RECIST v1.1.

0.5 and P < 0.05 were used to identify significantly differentially expressed genes (red). b, Hallmark GSEA of response and resistance-associated pathways from limma voom. c, Dot plot of significance values for interferon-gamma (IFN-γ) targets (n = 198 genes), proteasome subunits (n = 56 genes) and immunoproteasome subunits (n = 5 genes). Boxplot overlay depicts the 25th percentile (minima), 50th percentile (center) and 75th percentile (maxima) of distribution with whiskers bounding points within 1.5× interquartile range (Q3–Q1) from each minimum and maximum. Immunoproteasome subunits as a set showed a greater association with response than IFN-γ targets and proteasome targets (P = 7 × 10−9 and P = 4 × 10−6, respectively, two-sided Mann–Whitney U test). d, Contour plot of a linear, 2D model predicting expression of representative immunoproteasome subunit PSMB8 as a function of the inflammatory cytokines IFNG and TNF. Contour levels correspond to roughly 1.2-fold TPM increments in PSMB8 expression. Patients with high expression of both IFNG and TNF demonstrated the highest PSMB8 expression (R2 = 0.31). e, Logistic regression summary results for tumor-associated immune cell signatures derived from single-cell sequencing37./p>

10 mut/MB (favorable; n = 27), PD-L1 TPS ≥ 50% (favorable; n = 34) and PD-L1 TPS ≤ 1% (unfavorable; n = 18). Following FDR correction, we identified multiple near-significant and significant associations (q < 0.25 and 0.1, respectively; Extended Data Fig. 9b,c and Methods), particularly when evaluating features from the immune activation/exhaustion and wound healing clusters (dedifferentiated TI-1 in PD-L1 TPS ≤ 1% q = 0.23; immune-activated M-2 in PD-L1 TPS ≤ 1% q = 0.16; macrophage/monocytes in PD-L1 TPS ≥ 50% q = 0.06; hMono3 in PD-L1 TPS ≥ 50% q = 0.11). Therefore, the presence of these factors may augment prediction based on standard clinical variables./p>50×, contamination <5% and tumor purity >10% as assessed by ABSOLUTE (v1.5)79. Comparison of MutSig2CV80 driver analysis from the SU2C-MARK cohort agreed well with previously published results for TCGA lung adenocarcinoma (LUAD) and lung squamous cell carcinoma (LUSC) cohorts (Extended Data Fig. 2a)./p>

0.5, thus limiting our analysis to genes potentially involved in response. We further filtered out genes with sparse or low expression, that is more than 10% NA or zero values, or in the bottom 10% of mean expression. We transformed the values to fold changes by subtracting the median for each gene, then obtained the Spearman correlation matrix of these fold changes, and performed hierarchical clustering while varying the number of clusters (K) from 2 to 10 and repeating 500 iterations for each K value. We then obtained consensus matrices for each K (calculating the number of times samples clustered together in the 500 iterations), summed these matrices across all K values, and normalized the resulting matrix by the number of iterations. Using B-NMF with a half-normal prior, this matrix was used to decide on the optimal number of clusters. Using this empirically determined value of K, we then applied the B-NMF algorithm to the original log2TPM gene expression matrix. In this case, the gene expression matrix is approximated by W*H, where H is the cluster membership matrix and W is the gene weight matrix. We used the W matrix to narrow down the genes most closely associated with each cluster, keeping only genes in the top 50% of normalized weights for each cluster, as well as those with the largest difference between within-cluster versus outside-cluster expression. Using this reduced marker gene list, we classified the remaining samples in cohort 2 into our three-cluster scheme. Of note, given re-annotation of the RNA sample from patient SU2CLC-DFC-DF0732 as having been post-treatment, this specimen was removed from our analysis (Supplementary Note and Supplementary Fig. 1). We used this same procedure to define the TI subtypes, with the exception of initially filtering to keep high-variance genes (instead of keeping genes of interest from the differential expression analysis, as in the M subtypes). We similarly used TI marker genes to classify additional samples./p>

10 mut/MB, top; favorable), high PD-L1 tumor proportion score (PDL1 TPS) corresponding to PDL1 TPS ≥ 50% (middle; favorable), and low PD-L1 expression (PDL1 TPS ≤ 1%, bottom; unfavorable). Signed FDR q-values based on Benjamini–Hochberg adjustment of logrank p-values are plotted for each feature (Methods)./p>